抗siPOOL回補(bǔ)序列（進(jìn)一步的RNA干擾驗(yàn)證）

抗siPOOL回補(bǔ)序列(siPOOL-resistant rescue constructs)
用于進(jìn)一步的基因敲低驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證siPOOL產(chǎn)生的功能缺失表型是針對(duì)目標(biāo)基因的，因此，我們將為您提供一個(gè)抗siPOOL的回補(bǔ)序列。當(dāng)抗siPOOL回補(bǔ)序列在構(gòu)建的質(zhì)粒中表達(dá)時(shí)，靶基因的功能得到恢復(fù)，從而挽救或逆轉(zhuǎn)目標(biāo)基因功能缺失的表型。

圖1. 抗siPOOL的回補(bǔ)序列設(shè)計(jì)。橙色表示目的基因上的siRNA識(shí)別位點(diǎn)。其中，突出顯示編碼序列（CDS）上的一個(gè)siRNA識(shí)別位點(diǎn)。舉例：GTC密碼子（編碼Val氨基酸）與替代密碼子如圖所示，粗體顯示了轉(zhuǎn)錄組中含量較高的替代密碼子。

設(shè)計(jì)步驟：

1. 在siRNA識(shí)別位點(diǎn)選擇替代密碼子，改變mRNA序列，但不改變蛋白質(zhì)。

2. 對(duì)所有CDS中siRNA識(shí)別位點(diǎn)的所有密碼子進(jìn)行替換，直到達(dá)到足夠的錯(cuò)配。

3. 去除常見(jiàn)的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，添加側(cè)翼序列，將抗siPOOL的CDS克隆到載體中。

客戶(hù)數(shù)據(jù)：
案例1：siPOOL降低了激酶(X)的表達(dá)。抗siPOOL回補(bǔ)序列的表達(dá)恢復(fù)了激酶X的表達(dá)和功能，這表明了磷酸化底物X（p-底物X）的存在。

圖2. 在siPOOL介導(dǎo)的敲低和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)前后，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶激酶X及其磷酸化底物（數(shù)據(jù)由未披露的客戶(hù)提供）。


案例2：復(fù)合物的形成（通過(guò)熒光互相關(guān)光譜測(cè)量，FCCS）在一個(gè)攜帶標(biāo)記物的siPOOL介導(dǎo)的敲減后減少。而通過(guò)表達(dá)抗siPOOL回補(bǔ)序列，能夠恢復(fù)復(fù)合物的形成。

圖3. 在siPOOL介導(dǎo)的敲減和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)FCCS測(cè)量?jī)蓚€(gè)熒光標(biāo)記蛋白之間的復(fù)合物形成（數(shù)據(jù)由Intana Bioscience GmbH友情提供）。

抗siPOOL回補(bǔ)序列可以作為序列數(shù)據(jù)文件提供，或也可以克隆到標(biāo)準(zhǔn)/自定義結(jié)構(gòu)中提供。歡迎聯(lián)系我們?cè)斣?xún)抗siPOOL回補(bǔ)序列（進(jìn)一步的RNA干擾驗(yàn)證）。