DAP-seq技術在bHLH-zip轉錄因子調控靈芝代謝研究中的應用

靈芝酸（GAs）是一種三萜類化合物，是靈芝屬中的關鍵藥理活性化合物，具有多種生物學功能。然而，直接調控GA生物合成的轉錄因子仍然知之甚少。

該研究首先采用Illumina和PacBio測序策略對靈芝菌株的基因組進行了從頭測序和組裝，隨后進行了基因功能分析，并注釋了參與三萜類化合物和麥角甾醇生物合成的基因。然后，通過多個物種的基因保守性比對分析，篩選到了調控三萜生物合成的潛在bHLH-zip轉錄因子甾醇調節元件結合蛋白（SREBP）。

圖1. 在全基因組水平上鑒定SREBP的結合位點和基序

通過DAP-seq分析，在全基因組水平鑒定了轉錄因子SREBP的結合位點和靶基因。進一步對這些靶基因進行KEGG富集分析，發現包括三萜類化合物合成和脂質代謝相關途徑富集。電泳遷移實驗（EMSA）進一步驗證了SREBP與靶基因之間的相互作用。

圖2. RNA-seq分析顯示了SREBP調控靈芝三萜類、麥角甾醇和脂質生物合成基因的表達

通過RNA-seq與DAP-seq聯合分析，發現SREBP靶基因之中，參與類固醇和三萜類生物合成的甲羥戊酸激酶（g3941）和3-羥基-3-甲基戊二酰合成酶（g1941），以及參與麥角甾醇生物合成的甾醇異構酶（ERG2，g7787）和羊毛甾醇14-脫甲基酶（ERG11，g3908），在SREBP過表達菌株（OEP::SREBP）中顯著上調表達。此外，參與甘油磷脂/甘油脂代謝的3個靶基因，乙醇胺-磷酸轉移酶（g1208）、溶血磷脂?；D移酶（g4309）和心磷脂特異性磷脂酶（g4280）也顯著上調表達。次級代謝組學和脂質代謝組學分析發現，甲羥戊酸、羊毛甾醇、麥角甾醇和13種不同的GA以及多種脂質的含量在該SREBP過表達菌株中顯著增加。此外，當OE::SREBP菌株用外源性SREBP特異性抑制劑fatostatin處理時，SREBP過表達對三萜類化合物和脂質代謝的影響得以恢復。以上RNA-seq、次級代謝組學和脂質代謝組學的分析，揭示了SREBP的過表達通過促進GA、麥角甾醇和脂質生物合成相關靶基因的轉錄，導致GA、麥角甾醇和脂質代謝顯著增加。

圖3. SREBP調節靈芝GA、麥角甾醇和脂質生物合成的機制圖

總之，該研究在靈芝基因組中發現了一個bHLH-zip轉錄因子SREBP。DAP-seq鑒定了DNA序列5′-GRVGRVGRVGR-3′為最佳的SREBP結合基序，以及參與GA、麥角甾醇和脂質生物合成的關鍵靶基因。SREBP過表達菌株的進一步實驗研究闡明了SREBP在靈芝三萜類化合物和脂質代謝中的作用及其調控機制。

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