Science | DAP-seq助力揭示CsARF3調控黃瓜雌花形成分子機制

性別決定是高等植物發育的核心環節，對于黃瓜等葫蘆科作物而言，雌花的形成直接關乎果實與種子產量，更是保障糧食安全的關鍵所在。黃瓜的花原基初期本是雌雄同體，卻會在特定發育階段（如第5階段）通過雄蕊或雌蕊原基的選擇性停滯，最終分化為雄花或雌花。一直以來，乙烯與生長素都被證實能促進葫蘆科植物雌花形成，但二者調控性別決定的分子機制，以及它們之間如何協同作用，長期以來都是未解之謎。而作為生長素信號通路的核心因子，生長素響應因子（ARFs）雖已被證實參與植物多種發育過程，卻從未有研究報道其與植物性別決定相關——這一關鍵空白，也讓葫蘆科植物的“性別密碼"更顯神秘。

2025年12月11日，中國農業大學張小蘭團隊在國際頂刊Science上發表了一篇題為“ARF3-mediated auxin signaling is essential for sex determination in cucumber"的研究論文，該研究借助DAP-seq精準鑒定出黃瓜生長素響應因子CsARF3全基因組中的直接結合靶點，構建了其調控性別決定的下游基因網絡，闡明了CsARF3的雙重調控模式，揭示了生長素與乙烯在性別決定中的協同作用機制，為植物性別決定調控網絡的研究帶來全新突破。藍景科信為該研究提供了DAP-seq技術支持。

主要研究結果

（一）CsARF3是黃瓜雌花形成所必需的基因

本研究通過對兩性花黃瓜品系外源施加生長素，結果顯示雌花比例顯著提高，且16個黃瓜ARF基因中，僅CsARF3在雌性花芽中表達顯著高于雄性花芽，且在花性別決定前（6 期前）高表達。研究團隊構建了Csarf3突變體和CsARF3過表達株系，發現CsARF3突變雌花轉變為雄花，即使外施生長素也不能回補Csarf3突變體的表型；CsARF3過表達株系的雌花產量增加8.0%，復合雌花（每節多朵雌花）比例提高5.7%。以上結果表明，CsARF3介導的生長素信號通路對黃瓜雌花形成至關重要。

圖1 . CsARF3促進黃瓜雌性化

（二）CsARF3通過調控下游靶基因調控雌花發育

1. CsARF3激活 CsSTM表達

KNOX轉錄因子調控植物莖尖分生組織（SAM）的形成與心皮發育進程，為探究CsARF3介導的雌性發育是否依賴KNOX轉錄因子，通過基因表達分析發現，Csarf3突變體異常心皮中多數黃瓜I類KNOX家族成員表達下調，其中CsSTM下調顯著，且CsSTM在雌花芽中高表達、在Csarf3突變體中低表達、在CsARF3過表達株系中高表達。研究團隊通過酵母單雜交、EMSA、ChIP-qPCR、DLR分析驗證，CsARF3可直接結合CsSTM啟動子的P2/P4生長素響應元件（AuxRE）元件并激活其表達。接著，研究團隊構建了CsSTM突變體，結果顯示弱突變體雌雄花比例降低、雌花出現延遲，強突變體無法形成莖尖分生組織，且Csarf3 Csstm雙突變體表型與CsSTM單突變體相似。以上結果表明，CsSTM既有保守維持莖尖分生組織功能，又作為CsARF3的下游基因促進黃瓜雌花形成。

圖2. CsARF3通過直接刺激黃瓜中CsSTM的表達促進雌性化

2. CsARF3抑制CsWIP1表達

CsWIP1通過抑制心皮發育調控葫蘆科性別決定。CsARF3和CsWIP1在雌雄花芽的心皮原基中表達模式相反，二者突變體表型也相反，研究團隊進一步對二者的關系進行研究。CsWIP1在Csarf3突變體中表達量為野生型的3倍，過表達CsARF3則使CsWIP1表達降低，同時在CsWIP1啟動子鑒定到5個AuxRE元件。體外和體內實驗證實，CsARF3可直接結合P3元件；雙熒光素酶報告實驗證實，CsARF3可特異性抑制CsWIP1的轉錄活性。Cswip1 Csarf3雙突變體表現為雌全同株（可開雌花和兩性花）性狀，與僅開雄花的Csarf3突變體表型存在顯著差異，而與Cswip1突變體表型相近。以上結果表明，CsARF3在黃瓜中通過抑制CsWIP1的表達解除對心皮發育的抑制。

圖3. CsARF3在心皮發育過程中負向調控CsWIP1的表達

3. CsARF3的調控通路特征

通過DAP-seq分析，研究團隊進一步鑒定到CsARF3下游靶基因，包括心皮特征基因crabs claw（CRC）、agamous（AG）以及性別決定相關基因MYB62的黃瓜同源基因。轉錄水平檢測結果顯示，這些靶基因在Csarf3和Csstm突變體中均呈現共下調表達模式，而CsCUC2B的轉錄水平未發生顯著變化。此外，DAP-seq與RNA-seq聯合分析結果顯示，Csarf3突變體與野生型的差異表達基因中，67%與CsARF3結合靶點重疊，這些共有基因顯著富集于“花分生組織決定性"和“花器官特征決定"等關鍵通路；同時，Csarf3與Csstm突變體有118個共有差異表達基因。以上結果表明，CsARF3-CsSTM通路在黃瓜單性花發育中起作用，且可能獨立于CsCUC2B。

圖4. CsARF3的DAP-seq分析

（三）CsARF3與乙烯通路的互作關系

ACS1G作為被報道的與黃瓜雌性表型相關的乙烯合成基因，于花發育極早期表達并引發乙烯爆發以誘導雌花形成。研究發現，外源施加乙烯類似物乙烯利不能誘導Csarf3突變體形成雌花，而對僅開雄花的乙烯合成突變體Csacs11和Csaco2施加生長素則可成功誘導雌花形成，說明乙烯通過生長素發揮促雌性化作用。研究團隊通過Csarf3突變體與攜帶ACS1G的雌性系的雜交實驗證實，CsARF3突變可顯著阻斷ACS1G介導的雌花發育過程。值得注意的是，此前在甜瓜中的研究已證實，生長素可促進CmACS7表達并抑制雄蕊發育。為進一步探究這一機制，研究團隊檢測了黃瓜中CmACS7的同源基因CsACS2的表達，結果顯示CsACS2在Csarf3和Csstm突變體中表達顯著下調，而在CsARF3過表達株系中表達上調。以上結果表明，生長素能夠正向調控乙烯的生物合成，二者在黃瓜性別決定過程中形成了相互作用的調控關系。

圖5. 黃瓜中CsARF3與已知性別決定基因的遺傳關系

研究總結

本研究提出了黃瓜性別決定的分子模型：CsARF3作為核心調控因子，通過直接激活CsSTM和抑制CsWIP1兩條通路促進心皮發育，同時與乙烯通路形成互惠調控，抑制雄蕊發育，最終決定雌花形成。揭示了生長素與乙烯在性別決定中的分子互作網絡，為葫蘆科作物的性別調控育種提供了理論依據和關鍵基因資源。