在做完篩選或大片段互作實(shí)驗(yàn)后，若需進(jìn)一步精確定位蛋白質(zhì)與DNA的具體結(jié)合位點(diǎn)，EMSA實(shí)驗(yàn)往往是理想選擇。但實(shí)際操作中，面對探針設(shè)計(jì)、結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測等問題，是否會(huì)感到有些無從下手？別擔(dān)心，今天我們就手把手拆解 EMSA 實(shí)驗(yàn)中的探針設(shè)計(jì)要點(diǎn)，幫你輕松突破這一難關(guān)。
EMSA實(shí)驗(yàn)原理
EMSA，中文全稱為電泳遷移率實(shí)驗(yàn)，也被稱為凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，是研究蛋白質(zhì)與核酸相互作用的一種經(jīng)典體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其核心原理在于：標(biāo)記后的核酸探針與對應(yīng)結(jié)合蛋白特異性結(jié)合后，會(huì)形成分子量更大的“蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物"；由于該復(fù)合物在凝膠中的遷移速度遠(yuǎn)慢于游離探針，因此在凝膠上會(huì)表現(xiàn)為條帶的“滯后"或“阻滯"現(xiàn)象，若為Biotin標(biāo)記探針，可通過化學(xué)發(fā)光法顯影；若為放射性或熒光標(biāo)記，則需對應(yīng)采用放射自顯影或熒光成像檢測，最終通過條帶判斷結(jié)合是否發(fā)生。這一特性使得EMSA成為檢測蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合的有效工具。
已知核心結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測
預(yù)測目標(biāo)蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，可通過文獻(xiàn)資源明確目標(biāo)蛋白的保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、已知結(jié)合基序等先驗(yàn)信息，并結(jié)合專業(yè)數(shù)據(jù)庫提升預(yù)測準(zhǔn)確性。本文推薦使用JASPAR數(shù)據(jù)庫（收錄大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序，支持家族特異性篩選）進(jìn)行預(yù)測。以植物NAC轉(zhuǎn)錄因子家族家族為例，可先通過文獻(xiàn)確認(rèn)NAC家族的保守結(jié)合基序（如核心序列CACG），再在JASPAR中篩選NAC家族的代表性motif，進(jìn)而對特定NAC亞型的DNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。
1.搜索轉(zhuǎn)錄因子家族：在JASPAR網(wǎng)站的搜索欄中輸入目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子家族名稱“NAC"，點(diǎn)擊搜索。
2.選擇motif：從搜索結(jié)果中挑選出感興趣的motif，點(diǎn)擊“Add to cart"，完成后點(diǎn)擊“View cart"進(jìn)入分析界面。
3.輸入序列，設(shè)置參數(shù)：在紅框區(qū)域輸入待測序列（常見為基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS上游2000bp的啟動(dòng)子區(qū)域，可含TSS下游200-500bp），需為標(biāo)準(zhǔn)fasta格式，匹配閾值默認(rèn)是80%，該值代表預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)與數(shù)據(jù)庫中已知motif的序列相似性閾值，若需提高預(yù)測的嚴(yán)格性，可將閾值調(diào)整為85%，設(shè)置完成后點(diǎn)擊“Scan"啟動(dòng)分析。
4.解讀結(jié)果：
分析結(jié)果中，需重點(diǎn)關(guān)注兩項(xiàng)核心信息：
相對評估值（Relative Score）：代表預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)與目標(biāo) motif（基序）優(yōu)質(zhì)匹配序列的相似性百分比（0-100%），評分越高，序列匹配度越強(qiáng)；
預(yù)測的位點(diǎn)（Predicted sequence）：即預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，需結(jié)合其標(biāo)注的鏈方向（strand）處理，若標(biāo)注為負(fù)鏈（strand：-），需對該序列進(jìn)行 “反向互補(bǔ)"；
將處理后的預(yù)測序列（正鏈直接用，負(fù)鏈反向互補(bǔ)后用）在原始序列fasta序列中檢索，即可確定結(jié)合位點(diǎn)的具體坐標(biāo)，完成預(yù)測。
小技巧：如果數(shù)據(jù)過多，可通過“Filter“功能縮小范圍：輸入已確認(rèn)的保守結(jié)合序列即可。
探針設(shè)計(jì)
在確定了結(jié)合位點(diǎn)之后，接下來的工作便是進(jìn)行探針的設(shè)計(jì)。以下是幾個(gè)核心要點(diǎn)：
探針長度：通常控制在20-40個(gè)堿基對之間。序列過短可能導(dǎo)致結(jié)合不穩(wěn)定，過長游離探針遷移變慢、與低分子量蛋白復(fù)合物難以有效分離。
核心結(jié)合位點(diǎn)：探針應(yīng)完整包含核心結(jié)合位點(diǎn)及其兩端各5-15bp的側(cè)翼序列，且核心結(jié)合位點(diǎn)應(yīng)盡量位于探針中央，以確保結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性。
探針類型：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的探針類型。
Biotin標(biāo)記探針（野生型，Biotin-WT）：在探針的 5’端或 3’端引入Biotin標(biāo)記，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的信號(hào)檢測。
未標(biāo)記競爭探針（冷探針，Cold Probe）：與Biotin標(biāo)記探針序列相同，但不含Biotin標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)中加入過量冷探針，若能競爭性抑制Biotin-WT與目標(biāo)蛋白的結(jié)合（表現(xiàn)為顯影條帶減弱），可證明結(jié)合的特異性（排除非特異性結(jié)合）。
突變探針（Biotin-Mut）：側(cè)翼序列與野生型探針相同，將核心結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵堿基進(jìn)行突變（如ACGT變?yōu)锳AAA），若Biotin-Mut無法與目標(biāo)蛋白結(jié)合（顯影條帶消失），可進(jìn)一步驗(yàn)證核心結(jié)合位點(diǎn)的必要性。
以上就是本期的全部內(nèi)容啦，希望這篇從JASPAR入手的實(shí)戰(zhàn)指南能給您帶來幫助。如果您在實(shí)踐過程中遇到任何問題或有自己的心得，歡迎在評論區(qū)與我們分享討論。如果覺得本文有用，也請點(diǎn)個(gè)「贊」和「在看」支持一下吧！
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