EMSA助力揭示楊樹扦插生根中LBD16介導(dǎo)通路的保守性

2023年6月15日，北京林業(yè)大學(xué)林金星研究組、李曉娟研究組，中國(guó)科學(xué)院徐麟研究組聯(lián)合在The Innovation Life期刊上在線發(fā)表了題為“Transcriptome framework of root regeneration reveals the conservation of the LBD16-mediated pathway in poplar cuttings"的文章，揭示了楊樹扦插中不定根再生的轉(zhuǎn)錄組圖譜，并通過(guò)EMSA等一系列實(shí)驗(yàn)證明了LBD16在促進(jìn)不定根再生方面的保守作用。

扦插再生不定根是一種非常實(shí)用的樹木無(wú)性繁殖方法。楊樹是生長(zhǎng)快、生物量大的重要樹種，廣泛應(yīng)用了枝條扦插再生不定根技術(shù)。為解楊樹扦插中不定根再生的機(jī)制，作者對(duì)84K楊（Populus alba × Populus glandulosa）的莖損傷區(qū)域進(jìn)行了時(shí)序RNA測(cè)序（RNA-seq），基因集富集分析（GSEA）顯示，在不定根再生過(guò)程中，光合作用相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因、乙烯激活信號(hào)通路和脫落酸激活信號(hào)通路相關(guān)基因均快速上調(diào)，這些信號(hào)通路可能參與了損傷后莖的保護(hù)作用。與硝酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性相關(guān)的基因也迅速上調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞質(zhì)生長(zhǎng)素運(yùn)輸相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，與根、分生組織發(fā)育和分生組織維持相關(guān)的基因也在扦插損傷部位上調(diào)。通過(guò)分析不定根器官形成過(guò)程中與細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變有關(guān)的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)PagWOX11.1a/b和PagLBD16.2a/2b/3a表達(dá)上調(diào)，qRT-PCR分析證實(shí)了PagWOX11.1a/b和PagLBD16.3a/b在莖切割后的表達(dá)模式。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)許多擬南芥同源基因，在根頂端分生組織或側(cè)根器官形成中發(fā)揮干細(xì)胞生態(tài)位活性和細(xì)胞分化功能。此外，生長(zhǎng)素信號(hào)通路、生長(zhǎng)素運(yùn)輸和生長(zhǎng)素生物合成相關(guān)基因在根再生過(guò)程中均表達(dá)上調(diào)。這表明，在不同物種的扦插過(guò)程中，與根系再生有關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)可能是相似的。

隨后作者重點(diǎn)研究了LBD16在楊樹不定根再生中的作用，對(duì)LBD基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示在楊柳屬中存在兩個(gè)AtLBD16同源基因分支，即LBD16.2分支和LBD16.3分支，均位于IIIA亞類。雜交84K楊基因組包含4個(gè)LBD16基因，毛果楊（Populus trichocarpa）基因組包含兩個(gè)LBD16基因，過(guò)表達(dá)PtrLBD16.3 (35S_pro:PtrLBD16.3)顯著增強(qiáng)了84K楊的不定根再生，這表明LBD16蛋白在促進(jìn)不定根再生過(guò)程中可能具有進(jìn)化保守性。

楊樹屬植物LBD16.2和LBD16.3基因的啟動(dòng)子區(qū)存在許多保守區(qū)域，包括生長(zhǎng)素反應(yīng)元件（AuxREs）和WOX結(jié)合的順式作用元件（WOXCEs）。 qRT-PCR分析結(jié)果顯示，用合成生長(zhǎng)素1-萘乙酸（NAA）處理斷枝損傷區(qū)域，PagLBD16.3a/b表達(dá)上調(diào)，在84K楊中過(guò)表達(dá)PagWOX11.1a （35S_pro:PagWOX11.1a ）基因，PagLBD16.3a/b也表達(dá)上調(diào)。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）和電泳遷移（EMSA）實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PagWOX11.1a蛋白可能與PagLBD16.3a啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)WOXCE結(jié)合。這些結(jié)果表明，在楊樹再生不定根過(guò)程中，生長(zhǎng)素和WOX11可能上調(diào)LBD16的表達(dá)，這與擬南芥中WOX11-LBD16的分子途徑類似。

EMSA實(shí)驗(yàn)中探針序列為：5'-CATATTTGCATAAACCCATTAATAAATGTTCCCTGAA-3'，分別設(shè)置了不同濃度的冷探針與探針進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，冷探針量越多，結(jié)合條帶越淺，這說(shuō)明蛋白和探針有結(jié)合作用。

綜上所述，本研究以及其他楊樹WOX11和擬南芥的研究結(jié)果表明，生長(zhǎng)素、WOX11和LBD16促進(jìn)扦插不定根再生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能具有進(jìn)化保守性。因此，LBD16有望作為提升不同物種扦插生根效率的分子工具。