DAP-seq鑒定BcERF070下游靶基因，揭示乙烯調控小白菜開花機制

不結球白菜（Pak-choi），俗稱小白菜，是一種原產于中國的多葉狀蔬菜，已逐漸在世界范圍內種植。小白菜易于早熟的特性，限制了生長發育和產量積累。因此，了解小白菜的開花調控機制對育種和產業具有重要意義。

2024年1月25日，南京農業大學白菜系統生物學實驗室的研究成果發表在Plant Physiology期刊上（影響因子7.4），題目為“ETHYLENE RESPONSE FACTOR 070 inhibits flowering in Pak-choi by indirectly impairing BcLEAFY expression"。該研究使用DNA親和純化測序（DAP-seq）技術鑒定了小白菜中BcERF070的下游靶基因，揭示了BcERF070響應乙烯抑制小白菜開花的潛在分子機制。

1.BcERF070響應乙烯，延緩小白菜開花

在外源乙烯處理條件下，小白菜開花延遲，蓮座葉數量增加，BcERF070的表達增加，并在處理2 h時達到峰值。此外，BcERF070的轉錄水平在整個營養生長期逐漸下降，并在生殖期達到谷值。因此BcERF070參與了乙烯介導的開花調控。BcERF070基因沉默后，促進小白菜提早開花，蓮座葉數量降低，BcFT誘導表達。因此，BcERF070在小白菜開花過程中起到負向調節作用。乙烯處理的沉默植株開花時間明顯提前，但晚于未處理組。由此表明BcERF070參與小白菜開花調控的途徑有很多。

圖1. BcERF070基因沉默后促進小白菜開花，并響應乙烯。

2.BcERF070與BcMLP328相互作用

采用Y2H實驗篩選到了BcERF070的互作蛋白BcMLP328，隨后使用BiFC、LCI、GST pull down、Co-IP實驗驗證了這一結果。然而，BcERF070和BcMLP328相互作用調控開花的機制尚不清楚

圖2. BcERF070與BcMLP328相互作用。

3.BcMLP328促進小白菜開花

乙烯處理小白菜促使BcMLP328的表達量降低。此外，BcMLP328僅在花器官中高表達。這表明BcMLP328可能與開花過程有關。隨后在小白菜中構建了BcMLP328的過表達株系和沉默株系，通過表型觀察分析和開花相關基因（BcSOC1、BcSPL15、BcFT、BcAP3、BcTEM）表達量檢測，實驗結果表明BcMLP328促進小白菜開花。然而，BcMLP328促進開花的機制尚不清楚。

圖3. BcMLP328響應乙烯，并促進小白菜開花。

4.BcMLP328增強了BcbHLH30對BcLFY的轉錄活性

采用Y2H實驗篩選到了BcMLP328的互作蛋白BcbHLH30，隨后使用LCI、BiFC、Co-IP實驗驗證了BcMLP328和BcbHLH30在體內和體外的互作。隨后在小白菜中構建BcbHLH30沉默株系，發現在沉默株系中開花延遲、蓮座葉增多、開花調控基因（BcFT和BcLFY）表達量降低。這些結果表明，BcbHLH30正調控小白菜開花過程。

圖4. BcbHLH30與BcMLP328相互作用，促進小白菜開花。

采用Y1H實驗篩選BcbHLH30下游靶基因，發現BcbHLH30直接結合花相關基因BcLFY的啟動子，激活其表達。LUC實驗驗證了這一結論。隨后，ChIP-qPCR實驗檢測到在過表達BcbHLH30的小白菜株系中含有CATTTG-box的P2片段被顯著富集，EMSA實驗證明了BcbHLH30與BcLFY啟動子區的CATTTG-box結合。共轉化煙草葉片實驗表明BcMLP328增強了BcbHLH30對BcLFY的激活能力。

圖5. BcbHLH30與BcLFY啟動子結合并增強其表達。

5.BcERF070削弱了BcMLP328-BcbHLH30復合物對BcLFY的激活

為了驗證BcERF070對于BcMLP328與BcbHLH30互作的影響，使用LCI實驗證明，BcMLP328和BcbHLH30共轉染組中熒光明顯增強，然而在加入BcERF070之后，熒光強度顯著降低。EMSA實驗也驗證了這一結論。因此，BcERF070對BcMLP328與BcbHLH30的相互作用產生負向影響，這可能會降低BcMLP328-BcbHLH30復合物對BcLFY的轉錄激活。

推測BcERF070是通過破壞BcMLP328-BcbHLH30復合物進而延遲開花，那么BcMLP328沉默株系、BcERF070和BcMLP328雙沉默株系的開花時間理應相似。但出乎意料的是，BcERF070和BcMLP328雙沉默株系的開花時間早于BcMLP328沉默株系，蓮座葉也較少。由此推測BcERF070也可能通過破壞BcMLP328-BcbHLH30復合物以外的途徑來影響開花。

圖6. BcERF070削弱了BcMLP328-BcbHLH30復合物的激活活性。

6.BcERF070通過直接與BcBBX29啟動子結合增強其表達

采用DAP-seq分析可視化觀察到在Bcc29的啟動子區域存在較強的BcERF070結合峰，以及在BcBBX29的啟動子上可能存在結合區域。Y1H、Dual-LUC報告實驗、EMSA實驗進一步驗證了BcERF070與BcBBX29啟動子結合并激活其表達。與對照株系相比，BcBBX29沉默株系的開花時間更早、蓮座葉更少、BcFT表達更強。在過表達BcBBX29的擬南芥中觀察到開花時間更晚、蓮座葉更多。以上實驗結果表明，BcERF070通過直接激活BcBBX29的轉錄來延緩開花。

圖7. BcERF070直接與BcBBX29啟動子結合，激活其表達。

圖8. 小白菜中BcERF070調控晚開花的分子機制模型。

在沒有乙烯的情況下，BcERF070的表達量較低，導致開花提前。然而，在乙烯存在的情況下，BcERF070的表達被誘導，增加的BcERF070通過直接互作破壞BcMLP328-BcbHLH30復合物對BcLFY的激活，導致開花延遲；另外BcERF070還通過直接促進開花抑制子BcBBX29的表達來抑制BcFT的表達，進而誘導晚開花。

小結：該研究提出了BcERF070響應乙烯調控小白菜開花的分子機制。外源乙烯處理增加了BcERF070的表達，延緩了開花。BcERF070通過削弱小白菜中BcMLP328-BcbHLH30復合物對BcLFY的激活來延遲開花，此外BcERF070還直接促進開花抑制子BcBBX29的表達，從而降低BcFT的表達，進而延緩開花。本研究為乙烯介導的小白菜晚開花提供了見解，并為應用乙烯調控作物生產奠定了基礎。

文獻來源：Zhanghong Yu, Xiaoshan Chen, Yan Li, Sayyed Hamad Ahmad Shah, Dong Xiao, Jianjun Wang, Xilin Hou, Tongkun Liu, Ying Li. ETHYLENE RESPONSE FACTOR 070 inhibits flowering in Pak-choi by indirectly impairing BcLEAFY expression, Plant Physiology, 2024, kiae021,