茉莉酸類化合物（JAs）是植物中普遍存在的一類植物激素，在非生物脅迫響應中發揮重要作用。12-氧-植物二烯酸（OPDA）可通過α-亞麻酸（ALA）代謝途徑合成JA，是一種重要的JA前體分子。APETARA2/乙烯響應因子（AP2/ERF）轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一，對于調控植物發育、病原體防御和脅迫響應至關重要。一些ERF家族成員能夠響應植物激素和非生物脅迫信號，然而，關于單子葉植物（如：玉米、水稻）JA合成與功能的研究較少。
2023年6月16日，濟南大學生物科技與技術學院李慧教授團隊的研究成果，發表在植物學領域的TOP期刊Plant, Cell & Environment，文章題目為“ZmEREB57 regulates OPDA synthesis and enhances salt stress tolerance through two distinct signalling pathways in Zea mays"。該期刊的影響因子為7.947。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術鑒定了玉米中一個AP2/ERF轉錄因子的結合基序以及靶基因。揭示了ZmEREB57通過兩個不同的信號途徑調控玉米OPDA合成增強耐鹽性的分子機制，為耐鹽性植物新品種的培育提供了重要的遺傳資源。
本研究通過轉錄組分析篩選了與鹽脅迫相關的差異表達基因(DEGs)。其中，Zm00001eb193060在鹽脅迫條件下顯著上調表達，該基因編碼乙烯響應元件結合因子57 (ZmEREB57)，是一個AP2/ERF轉錄因子家族成員，定位于細胞核，并具有轉錄激活活性。定量PCR實驗表明，ZmEREB57可被多種類型的非生物脅迫誘導表達。
為進一步鑒定ZmEREB57的生物學功能，構建了ZmEREB57的過表達株系(OE1和OE2)和突變體株系(zmereb57-1和 zmereb57-2)。與野生型(WT)相比，2個zmereb57株系對鹽脅迫更加敏感，表現為明顯的葉片枯萎和褪綠，葉片含水量和葉綠素含量顯著下降；而2個OE株系表現出更好的耐鹽性。這表明ZmEREB57參與了玉米的鹽脅迫響應。此外，過表達擬南芥株系 (At-OE1、At-OE2、At-OE3)和突變體株系(atora47，ZmEREB57在擬南芥中的同源基因)的實驗結果與在玉米中類似，而且回補實驗還表明過表達ZmEREB57可以部分恢復atora47突變體的表型。以上結果表明，過表達ZmEREB57增強了玉米和擬南芥對鹽脅迫的耐受性。
通過DAP-seq分析，鑒定了ZmEREB57的特異性核心結合序列CCGNCC (屬于O-box樣基序)和606個潛在的靶基因。其中，丙二烯氧化物環化酶2（ZmAOC2）顯示出強烈的富集峰。酵母單雜交（Y1H）、熒光素酶報告實驗、凝膠阻滯實驗（EMSA）進一步驗證了ZmEREB57直接與ZmAOC2的啟動子結合。在鹽處理條件下，ZmEREB57的過表達促進了ZmAOC2的表達。
AOC定位于葉綠體，可催化13-過氧化氫亞麻酸形成OPDA，而后在過氧化物酶體中將其轉化為JA。zmaoc2突變體實驗表明，在對照處理組中zmaoc2株系的OPDA和JA含量均低于WT株系（B73），在鹽處理后zmaoc2株系與WT株系之間的OPDA和JA含量差異更大。這說明ZmAOC2參與了玉米OPDA和JA的合成。而且在鹽處理條件下，ZmEREB57-OE株系的OPDA和JA含量增加最多，其次是WT，最后是zmereb57株系。這表明ZmEREB57通過調控ZmAOC2的表達來影響內源性OPDA和JA的積累。外源OPDA處理后，WT和zmereb57植株中OPDA和JA水平均有顯著升高；外源JA處理后，植株中OPDA水平僅略有升高，JA水平顯著升高。此外，還發現外源OPDA或JA的應用可以通過增加內源OPDA和JA水平來幫助恢復zmereb57突變體的耐鹽表型。
為進一步探討OPDA/JA通路調控的基因在玉米鹽脅迫下的表達模式，對鹽脅迫處理以及OPDA或JA處理的WT植株進行了RNA-seq分析。分別篩選不同處理條件下的DEGs，并進行KEGG和GO富集分析，發現主要富集在與脅迫相關的各種生物途徑中。隨后，還對若干與鹽脅迫相關的DEGs開展了RT-PCR驗證。結果表明OPDA或JA處理引發的玉米轉錄組變化，參與了植物對鹽脅迫的響應。
值得注意的是，OPDA或JA處理后，玉米中的基因表達模式存在顯著差異。1351個基因（O&NRGs）對OPDA和NaCl有特異性反應，但對JA沒有反應；2933個基因（J&NRGs）對JA和NaCl有特異性反應，但對OPDA沒有反應。對O&NRGs和J&NRGs展開進一步的KEGG分析，主要富集到植物激素信號轉導和MAPK信號通路等與非生物脅迫響應有關的途徑中。因此，推測OPDA具有獨立的鹽脅迫響應機制。于是采用2個玉米JA合成突變體：zmaoc2（不能合成OPDA和JA）和zmopr3（JA生物合成缺陷）來驗證這一假設。zmaoc2和zmopr3株系均表現出更強烈的鹽脅迫敏感性。在鹽處理下添加外源OPDA時，zmaoc2和zmopr3的表型與WT相似。在鹽處理下添加外源JA時，僅zmopr3的表型與WT相似，而zmaoc2比zmopr3和WT對鹽脅迫更加敏感。
后續，選擇3個O&NRGs基因（ZAT10、ERF9、DREB1）和1個 J&NRGs 基因（VSP9a）進行分析，探究鹽脅迫下OPDA的響應機制。在對照條件下，4個基因在WT、zmaoc2 和zmopr3中的表達沒有明顯差別；在鹽處理條件下，4個基因在zmaoc2中表達水平顯著低于WT中；在鹽脅迫下添加OPDA時，增強了WT、zmaoc2 和zmopr3中ZAT10、ERF9和DREB1的表達；在鹽脅迫下添加OPDA和JA時，WT和zmaoc2中VSP9a明顯上調表達，而添加OPDA時僅僅是輕微的誘導表達。這說明OPDA可以通過一種不依賴于JAs的機制，作為玉米鹽脅迫響應的信號中介。
小結：本研究揭示了ZmEREB57正向調節玉米耐鹽性的分子機制。鹽脅迫誘導了ZmEREB57的表達，ZmEREB57通過與ZmAOC2啟動子中的O-box樣元件結合，激活其表達。進而通過兩個獨立的信號途徑調控OPDA和JA的生物合成（OPDA可以直接通過不依賴COI-1的途徑，或者間接地通過依賴JA-COI1的途徑調控脅迫相關基因的表達），增強玉米對鹽脅迫的耐受性。該研究為玉米、擬南芥和其他植物的耐鹽性新品種培育提供了重要的遺傳資源。
參考文獻：Zhu J, Wei X, Yin C, Zhou H, Yan J, He W, Yan J, Li H. ZmEREB57 regulates OPDA synthesis and enhances salt stress tolerance through two distinct signalling pathways in Zea mays. Plant Cell Environ. 2023 Jun 16. doi: 10.1111/pce.14644.
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