原核蛋白表達常見的問題有哪些？

　　原核表達是指通過基因克隆技術(shù)，將外源目的基因，通過構(gòu)建表達載體并導(dǎo)入表達菌株的方法，使其在特定原核生物或細胞內(nèi)表達。

　　一個完整的表達系統(tǒng)通常包括配套的表達載體和表達菌株。如果是特殊的誘導(dǎo)表達還包括誘導(dǎo)劑，融合表達還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗?zāi)康膩砜紤]，比如表達量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達產(chǎn)物的純化方法等等。下面介紹下原核表達過程中常見問題。

　　一、為什么目的蛋白總是以包涵體形式出現(xiàn)?

　　在原核表達純化中目的蛋白經(jīng)常發(fā)生錯誤折疊，并聚集成為包涵體。經(jīng)過誘導(dǎo)后目的蛋白表達通常可達細胞總蛋白的50%以上，雖然有一定比例的蛋白以可溶形式存在，多達95%的蛋白則存在于包涵體。為了獲得更多可溶蛋白，在實驗過程中，可以降低誘導(dǎo)溫度，例如16-30℃，或降低IPTG濃度（0.01-0.1mM）并延長誘導(dǎo)時間，還可以采用特別的培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌。

　　二、跨膜蛋白為什么很難表達?

　　跨膜蛋白的表達成功率相對較低是一個常見問題，主要原因可能有兩個：

　　1.跨膜蛋白一般都是強疏水性的氨基酸分子和親水性的分子跳躍式鏈接，形成的親水疏水的一個簡單的跨膜化學(xué)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)和信號肽結(jié)構(gòu)形似。而對于原核細胞來說，簡單的細胞器很難像真核細胞一樣完成信號肽的識別及切除、引導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體重新包裝及分泌這一復(fù)雜過程，有些蛋白多次跨膜，對于原核細胞來說幾乎是不可能完成的任務(wù)。

　　2.對于疏水性片段，在原核細胞表達中非常容易形成包涵體，疏水性多肽會抑制翻譯過程，甚至與原核膜結(jié)構(gòu)融合形成毒性，處于生物自我保護的本能，所有細胞器都會停止合成蛋白的過程。